Изоферменты , или изоэнзимы – это множественные формы фермента , катализирующие одну и ту же реакцию, но отличающиеся друг от друга по физическим и химическим свойствам, в частности по сродству к субстрату, максимальной скорости катализируемой реакции (активности), электрофоретической подвижности или регуляторным свойствам.

В живой природе имеются ферменты, молекулы которых состоят из двух и более субъединиц, обладающих одинаковой или разной первичной, вторичной или третичной структурой. Субъединицы нередко называют протомерами, а объединенную олигомерную молекулу – мультимером (рис. 14.8 а-г).

Считают, что процесс олигомеризации придает субъединицам белков повышенную стабильность и устойчивость по отношению к действию денатурирующих агентов, включая нагревание, влияние протеиназ и др. Однако на нынешнем этапе знаний нельзя ответить однозначно на вопрос о существенности четвертичной структуры для каталитической активности ферментов, поскольку пока отсутствуют методы, позволяющие в «мягких» условиях разрушить лишь четвертичную структуру. Обычно применяемые методы жесткой обработки (экстремальные значения рН, высокие концентрации гуанидинхлорида или мочевины) приводят к разрушению не только четвертичной, но и вторичной, и третичной структур стабильного олигомерного фермента, протомеры которого оказываются денатурированными и, как следствие, лишенными биологической активности.

Рис. 14.8. Модели строения некоторых олигомерных ферментов: а – молекула глутаматдегидрогеназы, состоящая из 6 протомеров (336 кДа); б – молекула РНК-полимеразы; в – половина молекулы каталазы; г – молекулярный комплекс пируватдегидрогеназы

Следует указать на отсутствие ковалентных, главновалентных связей между субъединицами. Связи в основном являются нековалентными, поэтому такие ферменты довольно легко диссоциируют на протомеры. Удивительной особенностью таких ферментов является зависимость активности всего комплекса от способа упаковки отдельных субъединиц. Если генетически различимые субъединицы могут существовать более чем в одной форме, то соответственно и фермент, образованный из двух или нескольких типов субъединиц, сочетающихся в разных количественных пропорциях, может существовать в нескольких сходных, но не одинаковых формах. Подобные разновидности фермента получили название изоферментов (изоэнзимов или, реже, изозимов ).

Одним из наиболее изученных ферментов, множественность форм которого детально изучена методом гель-электрофореза, является лактатдегидрогеназа (ЛДГ), катализирующая обратимое превращение пировиноградной кислоты в молочную. Она может состоять из четырёх субъединиц двух разных Н- и М- типов (сердечный и мышечный). Активный фермент представляет собой одну из следующих комбинаций: НННН, НННМ, ННММ, НМММ, ММММ или Н 4 , Н 3 М, Н 2 М 2 , НМ 3 , М 4 . Они соответствуют изоферментам ЛДГ 1 , ЛДГ 2 , ЛДГ 3 , ЛДГ 4 , и ЛДГ 5 . При этом синтез Н- и М-типов осуществляется различными генами и в разных органах экспрессируется по-разному.

Поскольку Н-протомеры при рН 7,0-9,0 несут более выраженный отрицательный заряд, чем М-протомеры, то изофермент Н 4 при электрофорезе будет мигрировать с наибольшей скоростью в электрическом поле к положительному электроду (аноду). С наименьшей скоростью будет продвигаться к аноду изофермент М 4 , в то время как остальные изоферменты будут занимать промежуточные позиции (рис. 14.9).

Рис. 14.9. Распределение и относительное количество изоферментов ЛДГ в различных органах

Для каждой ткани в норме характерно свое соотношение форм (изоферментный спектр) ЛДГ. Например, в сердечной мышце преобладает тип Н 4 , т. е. ЛДГ 1 , а в скелетных мышцах и печени – тип М 4 , т.е. ЛДГ 5 .

Эти обстоятельства широко используют в клинической практике, поскольку изучение появления изоферментов ЛДГ (и ряда других ферментов) в сыворотке крови может представлять интерес для дифференциальной диагностики органических и функциональных поражений органов и тканей. По изменению содержания изоферментов в сыворотке крови можно судить как о топографии патологического процесса, так и о степени поражения органа или ткани.

В одних случаях субъединицы имеют почти идентичную структуру и каждая содержит каталитически активный участок (например, -галактозидаза, состоящая из четырё субъединиц). В других случаях субъединицы оказываются неидентичными. Примером последних может служить триптофансинтаза, состоящая из двух субъединиц, каждая из которых наделена собственной (но не основной) энзиматической активностью, однако, только будучи объединенными в макромолекулярную структуру, обе субъединицы проявляют триптофансинтазную активность.

Термин «множественные формы фермента » применим к белкам, катализирующим одну и ту же реакцию и встречающимся в природе в организмах одного вида. Термин «изофермент » применим только к тем множественным формам ферментов, которые появляются вследствие генетически обусловленных различий в первичной структуре белка (но не к формам, образовавшимся в результате модификации одной первичной последовательности).

Ферменты: определение понятия, химическая природа, физико-химические свойства и биологическая роль ферментов.

Ферменты - это белки, которые действуют как катализаторы в биологических системах.

Химическая природа: белки.

Физико-химические свойства:

1) являются амфотерными соединениями;

2) вступают в те же качественные реакции, что и белки (биуретовую, ксантопротеиновую, фолина и др.);

3) подобно белкам растворяются в воде с образованием коллоидных растворов;

4) обладают электрофоретической активностью;

5) гидролизуются до аминокислот;

6) склонны к денатурации под влиянием тех же факторов: температуры, изменениях рН, действием солей тяжелых металлов, действием физических факторов (ультразвук, ионизирующее излучение и др.);

7) имеют несколько уровней организации макромолекул, что подтверждено данными рентгеноструктурного анализа, ЯМР, ЭПР

Биологическая роль: Ферменты катализируют контролируемое протекание всех метаболических процессов в организме.

Изоферменты. Строение, биологическая роль, диагностическое значение определения, изменение в онтогенезе и при патологии органа, диагностическое значение.

Изоферменты – это множественные формы одного фермента, катализирующие одну и ту же реакцию, но отличающие по физическим и химическим свойствам.

Строение: Четвертичная структура, образованная четным количеством субъединиц (2, 4, 6 и т.д.). Изоформы фермента образуются в результате различных комбинаций субъединиц.

Биологическая роль: Существование изоформ повышает адаптационную возможность тканей, органов, организма в целом к меняющимся условиям.

Диагностическое значение определения: По изменению изоферментного состава оценивают метаболическое состояние органов и тканей.

Изменение в онтогенезе: На примере ЛДГ (окисляет лактат до ПВК). В процессе индивидуального развития организма в тканях происходит изменение содержания кислорода и изоформ ЛДГ. У зародыша преобладают ЛДГ 4 , ЛДГ 5 . После рождения в некоторых тканях происходит увеличение содержания ЛДГ 1 , ЛДГ 2.

Изменения при патологии органа: На примере ЛДГ. ЛДГ 1,2 работают в миокарде. Если в миокард не будет поступать кислород, там увеличится количество анаэробных субъединиц – ЛДГ 4,5 , что свидетельствует о патологии органа.

Диагностическое значение:

ЛДГ – при увеличении активности ЛДГ в плазме крови можно предположить повреждение одной из тканей организма (сердце, мышцы, печень). (В норме 170-520 ЕД/л)

КК – (катализируют превращение кретина в креатинфосфат); определяют активность КК в плазме крови. В норме – 90 МЕ/л. Повышение ММ – травма мышц, ВВ – в крови не определяется даже при инсультах, т.к. не может проникнуть в кровь.

Когда мы говорим «малатдегидрогеназа» или «глюкозо-6-фосфатаза», то обычно имеем в виду конкретный белок, обладающий форментативной активностью, однако в действительности эти наименования охватывают все белки, катализирующие окисление малата в оксалоацетат или гидролиз глюкозо-6-фосфата с образованием глюкозы и . В частности, после выделения малатдегидрогеназы из различных источников (печени крысы, Е. coli) обнаружилось, что ферменты из печени и фермент из Е. coli, катализирующие одну и ту же реакцию, различаются во многих отношениях по своим физическим и химическим свойствам. Физически различимые формы ферментов, обладающие одним и тем же видом каталитической активности, могут присутствовать в разных тканях одного организма, в разных типах клеток одной ткани и даже в прокариотическом организме, например в Е. coli. Это открытие было сделано благодаря применению электрофоретических методов разделения белков, в результате чего были обнаружены электрофоретически разные формы определенной ферментативной активности.

Термин «изофермент» («изозим») охватывает все вышеупомянутые физически различимые белки с данной каталитической активностью, однако на практике, и особенно в клинической медицине, его употребляют в более узком смысле, подразумевая физически различимые и поддающиеся разделению формы данного фермента, присутствующие в различных типах клеток данного эукариотического организма, например человека. Изозимы неизменно обнаруживаются в сыворотке и в тканях всех позвоночных, насекомых и в одноклеточных организмах. При этом число ферментов и их содержание сильно варьируют. Известны изоферментные формы дегидрогеназ, оксидаз, трансаминаз, фосфатаз, трансфос-форилаз и протеолитических ферментов. В различных тканях могут находиться разные изоферменты, и эти изоферменты могут иметь неодинаковое сродство к субстратам.

Диагностическое значение изозимов

Медицинский интерес к изозимам возник после того, как было обнаружено, что сыворотка человека содержит несколько изозимов лактатдегидрогеназы и что их относительное содержание значительно изменяется при определенных патологических состояниях. Впоследствии было выявлено много других случаев изменения относительного содержания изозимов при разных заболеваниях.

Изозимы сывороточной лактатдегидрогеназы обнаруживаются после электрофореза при на крахмальном, агаровом или полиакриламидном гелях. При указанном значении изозимы несут разный заряд и распределяются на электрофореграмме в пяти разных местах. Далее изозимы можно обнаружить благодаря их способности катализировать восстановление бесцветных красителей в нерастворимую окрашенную форму.

Типичный набор реагентов для обнаружения изозимов дегидрогеназы включает:

1) восстановленный субстрат (например, лактат);

2) кофермент ;

3) краситель в окисленной форме (например, голубая нитротетразолиевая соль);

4) переносчик электронов от NADH к красителю [например, феназинметасульфат (ФМС)];

5) буфер; активирующие ионы (если требуются).

Лактатдегидрогеназа катализирует перенос двух электронов и одного иона от лактата к

Рис. 7.8. Реакция, катализируемая -лактатдегидрогеназой.

(рис. 7.8). Если электрофореграмму опрыскать приведенной выше смесью и затем инкубировать при то реакция сопряженного переноса электронов будет протекать только в тех местах, где присутствует лактатдегидрогеназы (рис. 7.9). Относительную плотность окраски полос можно далее оценить количественно с помощью сканирующего фотометра (рис. 7.10). Изозим с наибольшим отрицательным зарядом обозначают .

Физическая природа изозимов

Олигомерные ферменты, образованные разными протомерами, могут быть представлены несколькими формами. Часто определенная ткань продуцирует преимущественно один из протомеров. Если активный олигомерный фермент (например, тетрамер) может быть построен из таких протомеров в различных комбинациях, то образуются изозимы.

Изозимы лактатдегидрогеназы различаются на уровне четвертичной структуры. Олигомерная молекула лактатдегидрогеназы (мол. масса 130000) состоит из четырех протомеров двух типов, Н и М (оба с мол. массой около 34000). Каталитической активностью обладает только тетрамерная молекула.

Рис. 7.9. Локализация лактатдегидрогеназы на электрофореграммс с использованием системы сопряженных реакций.

Если порядок соединения протомеров не имеет значения, то протомеры могут быть скомпонованы пятью способами:

Маркерт подобрал условия для разрушения и реконструкции четвертичной структуры и сумел выяснить взаимоотношения между изозимами лактатдегидрогеназы. Расщепление и реконструкция лактат-дегидрогеназ I, и 15 не приводят к образованию новых изозимов. Следовательно, эти два изозима содержат только один тип протомеров. Когда такой же процедуре была подвергнута смесь лактатдегидрогеназ 1, и 15, появились также формы 12, 13 и 14. Соотношение изозимов соответствует приведенному ниже субъединичному составу:

Синтез Н- и М-субъединиц детерминируется разными генетическими локусами, и они по-разному экспрессируются в разных тканях (например, в сердечной и скелетной мышцах).

Изоферменты – это множественные формы одного фермента, катализирующие одну и ту же реакцию, но отличающие по физическим и химическим свойствам (сродству к субстрату, максимальной скорости катализируемой реакции, электрофоретической подвижности, разной чувствительности к ингибиторам и активаторам, оптимуму рН и термостабильности). Изоферменты имеют четвертичную структуру, которая образована четным количеством субъединиц (2, 4, 6 и т.д.). Изоформы фермента образуются в результате различных комбинаций субъединиц.

В качестве примера можно рассмотреть лактатдегидрогеназу (ЛДГ), фермент, который катализирует обратимую реакцию:

НАДН 2 НАД +

пируват ← ЛДГ → лактат

ЛДГ существует в виде 5 изоформ, каждая из которых состоит из 4-х протомеров (субъединиц) 2 типов М (muscle) и Н (heart). Синтез протомеров М и Н типа кодируется двумя разными генетическими локусами. Изоферменты ЛДГ различаются на уровне четвертичной структуры: ЛДГ 1 (НННН), ЛДГ 2 (НННМ), ЛДГ 3 (ННММ), ЛДГ 4 (НМММ), ЛДГ 5 (ММММ).

Полипептидные цепи Н и М типа имеют одинаковую молекулярную массу, но в составе первых преобладают карбоновые аминокислоты, последних – диаминокислоты, поэтому они несут разный заряд и могут быть разделены методом электрофореза.

Кислородный обмен в тканях влияет на изоферментный состав ЛДГ. Где доминирует аэробный обмен, там преобладают ЛДГ 1 , ЛДГ 2 (миокард, надпочечники), где анаэробный обмен - ЛДГ 4 , ЛДГ 5 (скелетная мускулатура, печень). В процессе индивидуального развития организма в тканях происходит изменение содержания кислорода и изоформ ЛДГ. У зародыша преобладают ЛДГ 4 , ЛДГ 5 . После рождения в некоторых тканях происходит увеличение содержания ЛДГ 1 , ЛДГ 2 .

Существование изоформ повышает адаптационную возможность тканей, органов, организма в целом к меняющимся условиям. По изменению изоферментного состава оценивают метаболическое состояние органов и тканей.

Изоформы креатинкиназы. Креатинкиназа (КК) катализирует реакцию образования креатинфосфата:

Молекула КК - димер, состоящий из субъединиц двух типов: М (от англ, muscle - мышца) и В (от англ, brain - мозг). Из этих субъединиц образуются 3 изофермента - ВВ, MB, MM. Изофермент ВВ находится преимущественно в головном мозге, ММ - в скелетных мышцах и MB - в сердечной мышце. Изоформы КК имеют разную электрофоретическую подвижность (рис. 2-36).

Активность КК в норме не должна превышать 90 МЕ/л. Определение активности КК в плазме крови имеет диагностическое значение при инфаркте миокарда (происходит повышение уровня МВ-изоформы). Количество изоформы ММ может повышаться при травмах и повреждениях скелетных мышц. Изоформа ВВ не может проникнуть через гематоэнцефалический барьер, поэтому в крови практически не определяется даже при инсультах и диагностического значения не имеет.

6. Локализация и компартментализация ферментов в клетке и тканях: ферменты общего назначения, органоспецифические и органеллоспецифические (маркерные) ферменты.

Ферменты по локализации делят на 3 группы:

I– общие ферменты (универсальные)

II- органоспецифические

III- органеллоспецифические

Общие ферменты обнаруживаются практически во всех клетках, обеспечивают жизнедеятельность клетки, катализируя реакции биосинтеза белка и нуклеиновых кислот, образование биомембран и основных клеточных органелл, энергообмен. Общие ферменты разных тканей и органов, тем не менее, отличаются по активности.

Органоспецифичные ферменты свойственны только определенному органу или ткани. Например: Для печени – аргиназа. Для почек и костной ткани – щелочная фосфатаза. Для предстательной железы – КФ (кислая фосфатаза). Для поджелудочной железы – α-амилаза, липаза. Для миокарда – КФК (креатинфосфокиназа), ЛДГ, АсТ и т.д.

Внутри клеток ферменты также распределены неравномерно. Одни ферменты находятся в коллоидно-растворенном состоянии в цитозоле, другие вмонтированы в клеточных органеллах (структурированное состояние).

Органеллоспецифические ферменты . Разным органеллам присущ специфический набор ферментов, который определяет их функции.

Органеллоспецифические ферменты это маркеры внутриклеточных образований, органелл:

Клеточная мембрана: ЩФ (щелочная фосфатаза), АЦ (аденилатциклаза), К-Nа-АТФаза

Цитоплазма: ферменты гликолиза, пентозного цикла.

ЭПР: ферменты обеспечивающие гидроксилирование (микросомальное окисление).

Рибосомы: ферменты обеспечивающие синтез белка.

Митохондрии: ферменты окислительного фосфорилирования, ЦТК (цитохромоксидаза, сукцинатдегидрогеназа), β-окисления жирных кислот.

Ядро клетки: ферменты обеспечивающие синтез РНК, ДНК (РНК-полимераза, НАД-синтетаза).

Ядрышко: ДНК-зависимая-РНК-полимераза

В результате в клетке образуются отсеки (компартменты), которые отличаются набором ферментов и метаболизмом (компартментализация метаболизма).

Среди ферментов выделяется немногочисленная группа р егуляторных ферментов, которые способны отвечать на специфические регуляторные воздействия изменением активности. Эти ферменты имеются во всех органах и тканях и локализуются в начале или в местах разветвления метаболических путей.

Строгая локализация всех ферментов закодирована в генах.

Определение в плазме или сыворотке крови активности органо- органеллоспецифических ферментов широко используется в клинической диагностике.